1996年,马伊琍与保剑峰、陈龙、高曙光、张雅琳共同出演了电视剧《真空爱情记录》,讲述了一群大学毕业生为了工作和爱情奋斗的故事。
1998年,马伊琍毕业于上海戏剧学院,毕业后参演了第一部改编自陕西驻沪作家李春平同名小说的电影《玻璃是透明的》,饰演“小丫子”。同年,其出演了第一部古装电影《孔乙己》。
2000年,通过出演《黑洞》提升了表演事业。同年,在电视剧《前世今生》中饰演美貌且气质超凡的秦婉莹。
2001年,出演电视剧《白天睡觉的女人》中的李秀。同年,在电影《西施眼》中饰演施雨,该片在2002年美国夏威夷国际电影节中获评审团大将及亚洲最佳电影。
2002年,因出演电视剧《还珠格格Ⅲ之天上人间》中的紫薇一角而被大众所熟知。
2004年,出演了由黄磊指导的《天一生水》,在剧中饰演一个混血姑娘明妮。
2005年,在张黎导演的电视剧《锦衣卫》中出演了倾国美人客印月。
2006年,参演的《乔家大院》在央视热播,其扮演的“江雪瑛”收获了更多的观众和粉丝。
2007年,因出演由赵宝刚指导的青春励志电视剧《奋斗》而名声骤起,同年6月底,马伊琍签约了内地影视巨擎橙天娱乐。
2008年,因拍摄电视剧《为谁心动》无悔剃光了头。同年,其凭借影片《江北好人》,战胜了李冰冰、范冰冰两位候选人,成为了长春电影节影后。
2009年,马伊琍与佟大为共同出演了电视剧《婚姻保卫战》。同年,出演的首部反映豫商故事的电视剧《经纬天地》在CCTV-8播出,这也是她继《乔家大院》之后首次登陆央视,剧中扮演尚达志的妻子顺儿。
2010年,与涂松岩合作主演都市题材电视剧《双城生活》,她在剧中塑造的北京大妞郝京妮,受到了网友的普遍好评。凭借该剧,马伊琍获得国剧盛典2011年度最佳女演员。
2013年年初,马伊琍与杜淳、刘莉莉、陈思斯等合作出演电视剧《青春期撞上更年期2》,此外,还客串了电影《不二神探》,并且彻底颠覆以往的形象痛骂文章,成为了影片一大看点。
2013年,首当制片人的马伊琍与首次当导演的丈夫文章合作了电视剧《小爸爸》。
2015年,出演了公路犯罪片《未择之路》。11月7日,在电视剧《北上广不相信眼泪》中饰演潘芸,凭该剧获得第19届华鼎奖中国百强电视剧最佳女主角。
2016年9月,与陈建斌合作主演都市幽默剧《中国式关系》,饰演美女建筑设计师江一楠。
2017年,主演文章执导的谍战剧《剃刀边缘》,剧中饰演关海丹。同年参演《建军大业》,饰演向*予角色。
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